تکنیک FISH
تکنیک Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) یا هیبریداسیون فلورسنت درجا یکی از دقیقترین روشهای تشخیص مولکولی و سیتوژنتیک است که برای شناسایی ناهنجاریهای کروموزومی و تغییرات ژنتیکی در سلولها به کار میرود. این تکنیک با استفاده از پروبهای DNA یا RNA نشاندار شده با رنگهای فلورسنت، امکان مشاهده مستقیم توالیهای ژنتیکی را در کروموزومها یا هسته سلول فراهم میکند.
در دهههای اخیر، FISH به یکی از ابزارهای اصلی در تشخیص سرطان، بیماریهای ژنتیکی، ناهنجاریهای کروموزومی و پزشکی شخصیسازیشده تبدیل شده است و امروزه در آزمایشگاههای پاتولوژی، سیتوژنتیک، هماتولوژی و ژنتیک پزشکی کاربرد گستردهای دارد.
—
تکنیک FISH چگونه عمل میکند؟
اساس این روش بر اتصال اختصاصی پروبهای فلورسنت به توالی هدف DNA است. به دلیل اتصال اختصاصی پروب به ناحیه موردنظر، این روش از دقت بسیار بالایی برخوردار است.
مراحل اصلی انجام آزمایش عبارتاند از:
– تهیه نمونه (بافت، خون، مغز استخوان یا سلول)
– تثبیت نمونه روی لام
– دناتوره کردن DNA
– هیبرید شدن پروب فلورسنت با توالی هدف
– شستشو برای حذف اتصالهای غیراختصاصی
– مشاهده زیر میکروسکوپ فلورسنت
– شمارش و تفسیر سیگنالها توسط متخصص
—
انواع پروبهای FISH
بسته به هدف آزمایش، انواع مختلفی از پروبها استفاده میشوند، هر نوع پروب برای بررسی نوع خاصی از تغییرات کروموزومی طراحی شده است.
– Locus Specific Identifier (LSI)
– Centromeric Enumeration Probe (CEP)
– Whole Chromosome Paint (WCP)
– Break Apart Probe
– Dual Fusion Probe
– Telomere Probe
– Subtelomeric Probe
—
کاربردهای FISH در تشخیص بیماریها
- تشخیص سرطان: بیشترین کاربرد FISH در تشخیص و طبقهبندی سرطانها است:
سرطان پستان : بررسی تقویت ژن HER2 برای انتخاب بیمارانی که به درمانهای هدفمند مانند تراستوزوماب پاسخ میدهند.
سرطان ریه: تشخیص بازآرایی ژنهای ALK- ROS1- RET که نقش مهمی در انتخاب داروهای هدفمند دارند.
لوسمیها: تشخیص جابهجاییهای کروموزومی مانند: BCR-ABL – PML-RARA – RUNX1- RUNX1T1 :
لنفومها : بررسی تغییرات ژنی مانند MYC – BCL2 – BCL6 : که در تشخیص و پیشآگهی بیماری اهمیت زیادی دارند.
۲. بیماریهای ژنتیکی FISH در تشخیص بسیاری از بیماریهای مادرزادی کاربرد دارد، از جمله:
– سندرم دیجورج
– سندرم ویلیامز
– سندرم پرادر ویلی
– سندرم آنجلمن
– حذفهای کروموزومی
– تریزومیهای کروموزومی
۳. تشخیص ناهنجاریهای کروموزومی قبل از تولد
نمونههای آمنیوسنتز یا پرزهای جفت میتوانند با استفاده از FISH از نظر وجود اختلالات کروموزومی بررسی شوند و نتایج اولیه معمولاً سریعتر از کاریوتایپ کلاسیک به دست میآید.
۴. بررسی ناباروری و سقط مکرر
FISH برای بررسی آنیوپلوئیدی اسپرم، اختلالات کروموزومی والدین و ارزیابی محصولات سقط نیز کاربرد دارد.
۵. ارزیابی پاسخ درمان
در برخی بدخیمیهای خونی، FISH برای پایش وضعیت ژنتیکی بیمار پس از درمان و بررسی باقیماندن سلولهای غیرطبیعی استفاده میشود.
—
مزایای تکنیک FISH
این تکنیک مزایای متعددی دارد که آن را به یکی از روشهای پرکاربرد آزمایشگاههای تشخیصی تبدیل کرده است:
– دقت بالا
– اختصاصیت بسیار مناسب
– قابلیت بررسی سلولهای در حال تقسیم و سلولهای غیرتقسیمی
– امکان استفاده روی نمونههای پارافینه (FFPE)
– سرعت بیشتر نسبت به کاریوتایپ کلاسیک در بسیاری از کاربردها
– مشاهده مستقیم تغییرات کروموزومی
– مناسب برای تشخیص حذف، افزایش تعداد ژن، جابهجایی و بازآراییهای کروموزومی
—
دقت و حساسیت FISH :
عملکرد تشخیصی FISH به عوامل مختلفی مانند کیفیت نمونه، طراحی پروب و نوع ناهنجاری بستگی دارد.
در صورت استفاده از پروبهای معتبر و اجرای صحیح آزمایش:
– حساسیت بسیاری از تستهای FISH معمولاً بیش از ۹۵ درصد است.
– اختصاصیت نیز در بسیاری از کاربردهای بالینی به بیش از ۹۸ درصد میرسد.
البته این اعداد ممکن است بسته به نوع بیماری، نوع پروب و شرایط آزمایشگاه متفاوت باشند. به همین دلیل هر آزمایش باید بر اساس دستورالعملهای معتبر و کنترل کیفیت داخلی و خارجی انجام شود.
—
عوامل مؤثر بر دقت نتایج
مهمترین عواملی که بر کیفیت نتایج FISH تأثیر میگذارند عبارتاند از:
– کیفیت نمونه
– زمان فیکساسیون
– نوع فیکساتیو
– کیفیت پروب
– قدرت میکروسکوپ فلورسنت
– کیفیت فیلترهای نوری
– نرمافزار تحلیل تصاویر
– تجربه کارشناس
– رعایت کنترل کیفیت
—
محدودیتهای تکنیک FISH
با وجود مزایای فراوان، این روش محدودیتهایی نیز دارد.
تنها نواحی شناختهشده را بررسی میکند
FISH فقط تغییراتی را شناسایی میکند که برای آنها پروب اختصاصی طراحی شده باشد و برای کشف جهشهای ناشناخته مناسب نیست.
تعداد ژنهای قابل بررسی محدود است
برخلاف NGS، در هر آزمایش تنها تعداد محدودی از اهداف ژنتیکی بررسی میشوند.
وابستگی به کیفیت نمونه
نمونههای نامناسب یا دارای فیکساسیون غیراستاندارد ممکن است باعث کاهش کیفیت سیگنالها و دشواری در تفسیر نتایج شوند.
—
آینده تکنیک FISH
با وجود توسعه فناوریهایی مانند NGS، تکنیک FISH همچنان جایگاه مهمی در تشخیص بالینی دارد. ترکیب FISH با پاتولوژی دیجیتال، هوش مصنوعی و نرمافزارهای تحلیل تصویر، موجب افزایش سرعت، کاهش خطاهای انسانی و بهبود دقت تشخیص شده است.
همچنین توسعه پروبهای چندرنگ (Multiplex FISH) و سیستمهای خودکار شمارش سیگنالها، آینده این فناوری را کارآمدتر و دقیقتر خواهد کرد.
—
جمعبندی
تکنیک FISH یکی از مهمترین روشهای تشخیص مولکولی در پزشکی نوین است که با دقت و اختصاصیت بالا، نقش کلیدی در تشخیص سرطانها، بیماریهای ژنتیکی، ناهنجاریهای کروموزومی و انتخاب درمانهای هدفمند ایفا میکند. اگرچه این روش محدودیتهایی مانند نیاز به پروب اختصاصی و تجهیزات پیشرفته دارد، اما به دلیل سرعت، قابلیت استفاده روی نمونههای پارافینه و توانایی شناسایی مستقیم تغییرات کروموزومی، همچنان یکی از ارزشمندترین ابزارهای آزمایشگاههای پاتولوژی و ژنتیک به شمار میرود. انتخاب پروبهای استاندارد، تجهیزات باکیفیت و اجرای صحیح کنترل کیفیت، تضمینکننده دستیابی به نتایج دقیق و قابل اعتماد در آزمایش FISH است.